逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)步驟

日期：2025-05-09 15:47
瀏覽次數(shù)：2
摘要： 逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription），是以RNA為模板合成DNA的過程，合成的DNA稱為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄過程遺傳信息的流動(dòng)方向?yàn)镽NA到DNA，與轉(zhuǎn)錄過程DNA到RNA的方向相反，故稱為逆轉(zhuǎn)錄。 實(shí)驗(yàn)步驟： 1、試劑化凍后，用手輕彈混勻后短暫離心。 2、 基因組DNA（gDNA）去除：根據(jù)RNA樣品的濃度按10pg~1μg計(jì)算用量，在RNase-free離心管中依次加入RNase-free ddH2O，5×gDNA Wiper Mix 2μL，RNA樣品，總體系為10μL。用移...

逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription），是以RNA為模板合成DNA的過程，合成的DNA稱為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄過程遺傳信息的流動(dòng)方向?yàn)镽NA到DNA，與轉(zhuǎn)錄過程DNA到RNA的方向相反，故稱為逆轉(zhuǎn)錄。



實(shí)驗(yàn)步驟：


1、試劑化凍后，用手輕彈混勻后短暫離心。


2、 基因組DNA（gDNA）去除：根據(jù)RNA樣品的濃度按10pg~1μg計(jì)算用量，在RNase-free離心管中依次加入RNase-free ddH2O，5×gDNA Wiper Mix 2μL，RNA樣品，總體系為10μL。用移液器吹打混勻后短暫離心。放入PCR儀，設(shè)置反應(yīng)條件為42℃ 2min。


3、第1鏈cDNA合成：根據(jù)上一步反應(yīng)管的數(shù)量按以下體系在RNase-free離心管中配制預(yù)混液：RNase-free ddH2O 5μL，逆轉(zhuǎn)錄引物（2μM）1μL，10×RT Mix 2μL，HiScript II Enzyme Mix 2μL，用移液器吹打混勻后短暫離心。在上一步得到的反應(yīng)管中每管加入10μL，用移液器吹打混勻后短暫離心。放入PCR儀，設(shè)置反應(yīng)條件為25℃ 5min，50℃ 15min，85℃ 5min。所得cDNA產(chǎn)物可立即用于qPCR反應(yīng)或-20℃保存。